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《中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)》 2017年
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CRISPR/Cas9技术对脊尾白虾蜕皮抑制激素基因的靶向敲除研究

宋凤阁  
【摘要】:甲壳动物的蜕皮与生长密切相关。已有的研究表明蜕皮抑制激素MIH在甲壳动物蜕皮过程中起着负调节作用。但是,由于甲壳动物功能基因研究平台的限制,迄今为止未见在活体内通过基因敲除的方法对甲壳动物MIH基因功能进行研究的报道。在前期研究中,本课题组成功实现了基于CRISPR/Cas9技术的脊尾白虾基因组编辑。本论文以脊尾白虾为研究对象,在其转录组数据基础上,成功获得了脊尾白虾MIH(Ec MIH)的全长序列,并对该基因表达特征进行了分析。在此基础上,通过共注射体外转录的Cas9 m RNA和g RNA的方法成功敲除了Ec MIH,获得幼体发育时间缩短的脊尾白虾个体,同时对其功能进行了初步研究。此外,本研究成功构建了Cas9核酸内切酶的分泌型表达载体p CT7-CHISP6H-Cas9,制备了Cas9重组蛋白,并在体外检测了其对脊尾白虾基因组编辑的可行性。主要结果归纳为以下两个方面:1.通过对脊尾白虾转录组数据分析和PCR验证确定了脊尾白虾Ec MIH的基因信息,获得了该基因的全长序列。Ec MIH的开放阅读框编码119个氨基酸,预测的分子量为13747.82 Da,等电点8.61,其基因由3个外显子和2个内含子组成。荧光实时定量PCR检测了Ec MIH在不同组织、不同发育时期以及不同蜕皮时期的表达特征。另外,在第二个外显子上设计并体外转录合成Ec MIH g RNA,通过脊尾白虾胚胎显微注射的方法将体外转录的Cas9 m RNA和Ec MIH g RNA共注射脊尾白虾单细胞时期受精卵。在Ec MIH g RNA靶标位点两侧设计检测引物对扩增目的片段,PCR产物测序以及单克隆检测分析结果均表明实验组脊尾白虾个体的基因靶标位点发生了碱基缺失突变,突变率达42.9%。对Ec MIH功能初步分析结果显示,基因被敲除后的脊尾白虾幼体发育至仔虾的时间由11天减少为8天,而其形态与生长发育等与野生型脊尾白虾相比没有明显差异。2.以Cas9P-1EA为模板设计引物扩增Cas9成熟肽序列,根据In-fusion○R HD Clontech kit将其和Pma C I酶切的p CT7-CHISP6H线性化质粒进行反应构建分泌型表达载体p CT7-CHISP6H-Cas9。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行重组表达,Western blot检测分析获得分泌表达的Cas9核酸内切酶。亲和层析以及脱盐纯化得到具有生物活性的重组蛋白,并且该重组蛋白可以在g RNA的指导下体外切割靶标质粒,分析了其对脊尾白虾基因组编辑的可行性。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S917.4

【参考文献】
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