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《中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)》 2017年
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四种类型CpG ODNs对水产养殖甲壳动物免疫调节作用的初步研究

徐建超  
【摘要】:水产养殖动物病害的频繁发生,已成为制约我国水产养殖可持续发展的主要瓶颈之一。环境友好型免疫增强剂的开发日渐成为领域内研究热点,其中CpG ODNs(Oligodeoxynucleotides)因其良好的抗菌、抗病毒效果而受到广泛关注。本研究以经济甲壳动物凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,运用分子生物学及细胞生物学的相关手段,研究了不同类型CpG ODNs的免疫识别及其激活的下游免疫应答反应,明确了其抗病毒免疫效果及作用机制,为CpG ODNs在甲壳动物养殖中的应用提供理论依据。分析比较了四种不同类型CpG ODNs(CpG-A,CpG-B,CpG-C和CpG-P)的抗病毒效果。不同类型CpG ODNs处理凡纳滨对虾12小时后注射WSSV检测对虾鳃中的病毒拷贝数,发现注射WSSV后第五天,四种类型CpG ODNs处理组对虾鳃中病毒载量分别是对照组的18.19%,48.82%,57.75%和47.65%,抑制病毒的效果依次为CpG-ACpG-PCpG-BCpG-C,且CpG-A组的抑制效果与其余三组有显著差异。说明四种类型CpG ODNs均能够在不同程度上抑制凡纳滨对虾体内病毒拷贝数,且CpG-A具有相对较强的抗病毒免疫效果,可作为免疫增强剂应用于养殖对虾的抗病毒免疫防治中。运用体内刺激实验和体外表面等离子体共振(SPR)技术研究LvTolls(LvToll1、LvToll2、LvToll3)对不同类型CpG ODNs的免疫识别活性。发现不同CpG处理后三种LvTolls的mRNA表达水平均有升高。与其他三种CpG ODNs处理及对照组相比,凡纳滨对虾肝胰腺中三种LvTolls的mRNA表达量在CpG-A处理后24小时显著升高,且LvToll1的mRNA表达水平显著高于LvToll2和LvToll3。CpG-P组凡纳滨对虾肝胰腺中LvTolls的表达也显著升高,而CpG-B和CpG-C处理组的升高幅度相对较小,且上调幅度均低于CpG-A处理组。在体外实验中,三种LvToll胞外段重组蛋白(LvToll-ECDs)具有显著的体外结合CpG-A的特性,该结合活性显著高于其他类型CpG ODNs。且LvToll1-ECD与CpG-A的结合活性均显著高于其他两种LvToll-ECDs与CpG-A的结合活性。以上结果表明CpG-A是激活凡纳滨对虾Toll通路的重要CpG类型,且推测LvToll1是CpG-A在凡纳滨对虾体内的主要受体。探讨了四种不同类型CpG ODNs诱导的下游免疫应答。发现CpG-A和CpG-B处理后凡纳滨对虾血细胞的吞噬能力和ROS水平显著升高,表明CpG-A和CpG-B能够激活凡纳滨对虾的细胞免疫应答;检测了对虾IRF-Vago-JAK/STAT通路相关指标,发现CpG-A处理后,对虾肝胰腺中LvIRF、LvVago4、LvVago5和LvSTAT的mRNA表达水平显著升高,血浆中类干扰素(IFN)含量显著增加,表明CpG-A能够激活对虾IFN system-like抗病毒系统,在对虾抗病毒免疫中起到重要作用。此外,CpG-B能够提高血浆中肿瘤坏死因子(TNF)的含量,CpG-C能够提高血浆中白细胞介素(IL)的含量,CpG-A和Cp G-P能够提高血浆中类IFN的含量,与其在高等动物中的作用类似,表明不同类型CpG ODNs在凡纳滨对虾中的免疫激活作用存在差异。利用RNA干扰技术干扰EsMyD88表达后检测CpG ODNs相关免疫指标的变化,探究CpG ODNs激活甲壳动物免疫反应的机制。结果显示,混合型CpG ODNs可以显著诱导中华绒螯蟹免疫相关基因EsProPO、Crus Es2、EsCAM、EsLITAF和EsmtMnSOD的mRNA表达,但是在干扰EsMyD88和CpG ODNs共处理后,这些基因的表达水平较CpG ODNs单独处理组显著降低,同时血浆中类IFN、IL和过氧化氢酶(CAT)的含量也显著低于CpG ODNs单独处理组的水平。推测CpG ODNs对中华绒螯蟹的部分免疫激活作用是由EsMyD88介导的。综上所述,作为一种新型的免疫增强剂,CpG ODNs可以通过Toll通路激活甲壳动物固有免疫系统,诱导细胞免疫和体液免疫进而抵御病原入侵;不同类型CpG ODNs的免疫激活作用存在差异,其中A型最好,研究结果为其在水产养殖中的应用提供理论依据。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S948

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
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【共引文献】
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【相似文献】
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