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《中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)》 2017年
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脊尾白虾抗脂多糖因子的鉴定及功能研究

吕新嘉  
【摘要】:抗菌肽作为甲壳动物免疫应答产生的一类重要效应分子,在甲壳动物的先天免疫中起着重要作用。抗脂多糖因子(ALF)作为抗菌肽的一种类型,因其广谱的抗菌和抗病毒作用,引起研究者更多的关注。脊尾白虾繁殖周期短,可在实验室实现全年养殖,且可以感染细菌和病毒等多种病原,易于进行相关实验操作,因而脊尾白虾被认为是研究甲壳动物先天免疫的模型动物。本论文以脊尾白虾作为模型动物,分离鉴定了脊尾白虾抗脂多糖因子(ALF)的不同转录本(EcALFs),分析了不同转录本的组织表达特征,研究了其功能,为进一步利用脊尾白虾作为模型动物进行抗病药物的开发奠定了基础。论文主要研究进展如下:1.从脊尾白虾中分离鉴定了ALF的6种不同转录本(EcALF1-EcALF6),不同转录本呈现出不同的组织表达特征。EcALF1、EcALF3、EcALF5在所检测的各组织中均有表达,其中,在血细胞中的表达量最高,在鳃和表皮中也有较高的表达;EcALF2在胃中表达量最高,在表皮也有较高的表达;EcALF4在表皮中表达量最高,在胃、鳃和血细胞中也有较高的表达;EcALF6在鳃中的表达量最高,在表皮、胃中表达量较高。总体上看,EcALFs基因的表达主要集中在血细胞、表皮、鳃和胃等与免疫密切相关的器官,表明其在脊尾白虾先天免疫中可能起着重要作用。2.依据EcALFs的脂多糖结合结构域(LBD)序列人工合成了EcLBDs多肽,对其最小抑菌浓度(MIC)进行了检测,分析了其对细菌的抑菌作用。结果表明,EcLBDs对多种革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均具有抑菌效果。其中EcLBD1、EcLBD2和Ec LBD3具有较为广谱的抑菌活性,EcLBD1对革兰氏阴性菌中的溶藻弧菌、哈维氏弧菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为2~4μM及16~32μM,对革兰氏阳性菌藤黄微球菌的MIC值为4~8μM;Ec LBD2对革兰氏阳性菌中的表皮葡萄球菌、藤黄微球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为16~32μM及8~16μM,对革兰氏阴性菌溶藻弧菌的MIC值为4~8μM;Ec LBD3对哈维氏弧菌和美人鱼发光杆菌的最小抑菌浓度为8~16μM及32~64μM,对藤黄微球菌的最小抑菌浓度为32~64μM。Ec LBDs各亚型对不同细菌具有不同的抑菌活性,说明其在脊尾白虾体内可能是相互协同发挥作用。3.通过将WSSV分别与不同的Ec LBDs多肽孵育后再感染脊尾白虾的方法检测了EcLBDs的抗病毒活性。WSSV在与EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3、EcLBD4、EcLBD5多肽孵育后感染脊尾白虾,其体内的病毒拷贝数比与EGFP蛋白孵育后病毒拷贝数显著降低,说明EcALFs具有明显的抗病毒活性。4.采用RNA干扰技术,研究了EcALFs在脊尾白虾体内的功能。结果显示:不同EcALFs被dsRNA沉默后,均引起脊尾白虾肝胰腺发生病变,并导致其肝胰腺中细菌数量发生不同程度的增加。注射EcALF1 dsRNA、EcALF3 dsRNA、EcALF4 dsRNA、EcALF5 dsRNA、EcALF6 ds RNA的脊尾白虾肝胰腺中细菌的携带量分别为注射EGFP dsRNA的脊尾白虾细菌携带量的38倍、66倍、78.6倍、75倍以及42.7倍。将其中一种EcALF基因沉默后,其他几种EcALFs基因的表达量也发生显著的变化,且多数EcALFs表达下调。EcALFs基因被沉默后,脊尾白虾的免疫水平发生明显变化,该变化可能是导致其肝胰腺中细菌数量大量增加并发生病变的原因。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78

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