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《中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)》 2017年
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牙鲆性类固醇激素合成重要基因表达调控的初步研究

梁冬冬  
【摘要】:性类固醇激素如雌二醇、睾酮等在鱼类性腺分化和发育中是必不可少的因素,其合成需要一系列蛋白和酶的作用。胆固醇在类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)的作用下由线粒体外膜转运到线粒体内膜,并在位于线粒体内膜上的胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a)的作用下转化成孕烯醇酮。这两步都是类固醇激素合成途径中上游的关键限速步骤。其下游的雌酮转化为雌二醇过程则是由17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD1)参与催化的。本研究以重要海水养殖鱼类牙鲆(Paralichthys olivaceus)为研究对象,通过对上述在性类固醇激素合成途径中有重要作用的三个基因(StAR2、cyp11a和17β-HSD1)组织差异表达和性腺分化期差异表达谱,以及cAMP、NR5a2、NR0b1等信使分子或转录因子对其表达调控作用的研究,探讨它们在牙鲆性腺分化和发育中的作用,为进一步阐明牙鲆雌雄性别形成机制提供有益的参考。以下为详细的研究结果。从牙鲆雌雄性腺转录组数据库获得StAR2、cyp11a和17β-HSD1基因的部分片段。通过克隆在牙鲆精巢中获得843bp和657bp两条StAR2,分别编码280和218个氨基酸,cDNA序列全长为1249和1063bp;而cyp11a基因的cDNA序列全长为1141bp,其中ORF为825bp,编码275个氨基酸;17β-HSD1基因的ORF为873bp,编码290个氨基酸。系统进化分析显示,牙鲆这三个基因与其他硬骨鱼类同源基因均有很高的相似性。利用RT-PCR分析了这三个基因在牙鲆雌雄成鱼性腺(雄鱼为II期、雌鱼为III期性腺)及其他组织中的表达模式。结果表明,StAR2和cyp11a两基因主要在性腺中表达,并呈现雌雄二态性,即精巢中的表达要高于卵巢中的表达。在雌雄鱼其他组织之间也呈现差异表达。StAR2a和StAR2b基因还在雌雄个体的胃和脑组织中表达;StAR2a也在雄性个体的心脏组织和雌性个体脾脏组织中表达,StAR2b在雄性个体心脏和雌性脾脏、肠和眼组织中表达。原位杂交(ISH)和免疫组化(IHC)结果显示,StAR2a主要在卵巢的鞘膜细胞和卵母细胞,以及精巢的Leydig细胞中表达。cyp11a除了在性腺中表达,仅在头肾组织中表达,且在雌性个体的头肾表达量比雄性的高;ISH和IHC结果显示,其也在卵巢的卵母细胞以及精巢的Leydig细胞中表达。17β-HSD1基因则在卵巢高表达,精巢中仅有少量表达,并且在雌性个体的鳃、头肾、肾、脾、胃和肠中也有表达。通过定量RT-PCR方法(qPCR),分析了这三个基因在高温(HT)和外源性激素雌二醇(E2)与睾酮(T)处理条件下的牙鲆性腺分化期性腺中的表达差异,并采用ELISA方法检测了该过程中幼鱼内源的胆固醇和孕烯醇酮水平。qPCR结果表明,对照组中,StAR2和cyp11a基因在性腺分化期的表达呈相对稳定的趋势,但17β-HSD1在性腺分化期的表达呈下降趋势。E2组中,StAR2和cyp11a在卵巢分化时维持相对较高的表达量,卵巢分化完成后两基因的表达量呈显著下降趋势(P0.05);孕烯醇酮在分化的卵巢中处于低水平。17β-HSD1在卵巢分化时的表达维持稳定,而卵巢分化完成后则呈上升趋势,随后呈下降趋势,最后维持在较高水平。T组中,三个基因在精巢分化前均高表达,在精巢分化完成后各基因的表达量开始显著下调(P0.05)。HT组中,StAR2和cyp11a基因表达量在精巢分化前保持稳定表达水平,精巢分化时都显著上调(P0.05),分化完成后均显著下降(P0.05);17β-HSD1的表达与T处理组类似,只是其表达水平整体相对较低。HT组胆固醇的处于高水平,但孕烯醇酮的水平高于对照组;T睾酮组胆固醇和孕烯醇酮都处于高水平。第二信使cAMP和转录因子(NR5a2和NR0b1)在牙鲆精巢原代细胞中对这三个基因表达的调控研究显示,cAMP对StAR2、cyp11a基因都有调控作用,且是剂量依赖的:低浓度cAMP可以下调它们在精巢原代细胞中的表达,高浓度cAMP则上调它们的表达;cAMP也可以显著抑制精巢原代细胞中17β-HSD1的表达(P0.05)。转录因子NR5a2和NR0b1则能显著上调精巢原代细胞中StAR2和cyp11a基因的表达(P0.05),且也是剂量依赖的,在较高剂量作用下它们的上调作用会减弱。而较高浓度的NR5a2可以显著抑制17β-HSD1表达,且随着浓度的升高抑制效果增强(P0.05);但是,低浓度NR0b1显著抑制精巢原代细胞中17β-HSD1的表达,较高浓度NR0b1则显著上调17β-HSD1基因表达(P0.05)。
【学位授予单位】:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S917.4

【参考文献】
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