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《中国科学院武汉病毒研究所》 2017年
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人博卡病毒(HBoV1)感染性克隆的构建及其NS1和NS1-70蛋白对NF-κB信号通路的调节

刘庆世  
【摘要】:本论文包括硕博连读期间的两个研究项目,分别围绕HBoV1感染性克隆的构建和HBoV1对天然免疫的调节展开。第一部分,我们成功构建了插入了EGFP基因的全长HBoV1感染性克隆(pIHBoV1wh-GFP)。感染性克隆的构建,是开展基础病毒学研究的基础工作。在这篇文章中,我们首先构建了武汉株博卡病毒的感染性克隆pIHBoV1wh。并验证了pIHBoV1wh在HEK293T细胞中转录、复制和产生病毒粒子的能力。同时,我们构建了插入了EGFP基因的全长HBoV1克隆pIHBoV1wh-GFP。pIHBoVwh-GFP能够在转染的HEK293T细胞中转录、翻译、复制和产生子代病毒(HBoV1wh-GFP),并且包装的病毒基因组是全长的。由于EGFP蛋白高度灵敏,易于检测,因此为寻找新的易感宿主提供了有力工具。同时,可以作为转基因治疗的载体,携带更大的基因,用于治疗肺部疾病。第二部分,我们证明了HBoV1 NS1、NS1-70蛋白可以抑制NF-κB信号通路的激活。HBoV1属于细小病毒科,是在世界范围内引起婴幼儿急性呼吸道感染的单链DNA病原体。NF-κB转录因子通过激活许多生理过程在入侵病毒的清除中发挥关键作用。以前的研究表明,HBoV1感染可以显著上调TNF-α的水平,而TNF-α是NF-κB信号通路的强刺激物。我们这篇文章主要探索HBoV1蛋白是否调节TNF-α介导的NF-κB信号通路激活。我们发现HBoV1 NS1和NS1-70蛋白抑制TNF-α刺激的NF-κB激活。NS1和NS1-70蛋白可以抑制TNF受体相关因子2(TRAF2)、IκB激酶α(IKKα)、IκB激酶β(IKKβ)、IKKβ持续性激活型突变体(IKKβSS/EE)或p65-诱导的NF-κB激活。此外,NS1和NS1-70不抑制TNF-α介导的IκBα磷酸化和降解,也不抑制p65的入核。免疫共沉淀实验证实NS1和NS1-70与p65的相互作用。值得注意的是,NS1抑制TNF-α介导的p65 ser536位点磷酸化,而NS1-70不抑制。我们的研究结果揭示HBoV1 NS1和NS1-70蛋白抑制NF-κB激活。我们证明HBoV1可以抑制NF-κB信号通路激活,为揭示HBoV1的免疫逃避机制,探索其致病性提供了重要依据。
【关键词】:人博卡病毒 NF-κB信号通路 感染性克隆
【学位授予单位】:中国科学院武汉病毒研究所
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373;Q78
【目录】:
  • 致谢4-5
  • 摘要5-6
  • SUMMARY6-12
  • 第一部分 构建和描述插入EGFP基因的武汉株博卡病毒感染性克隆(pIHBoV1wh-GFP)12-44
  • 第1章 绪论12-26
  • 1.1 选题的目的和意义12-13
  • 1.2 研究背景13-26
  • 1.2.1 HBoV的发现、命名和分类13-14
  • 1.2.2 HBoV的形态和结构14-15
  • 1.2.3 HBoV编码的蛋白及其功能15-18
  • 1.2.4 HBoV的复制方式18-22
  • 1.2.5 细小病毒AAV能容纳的基因组大小22
  • 1.2.6 细小病毒发夹结构及其功能22-24
  • 1.2.7 病毒感染性克隆的构建及其意义24-26
  • 第2章 实验材料和方法26-30
  • 2.1 细胞培养和转染、质粒构建及抗体26
  • 2.2 Western Blot实验26
  • 2.3 免疫荧光(IF)实验26
  • 2.4 扩增和纯化病毒粒子26-27
  • 2.5 RNA提取、病毒基因组分离和聚合酶链式反应(PCR)分析27
  • 2.6 病毒粒子的电镜观察(TEM)27-28
  • 2.7 分离低分子量DNA(Hirt DNA)及Southern blot分析28-30
  • 第3章 实验结果30-38
  • 3.1 武汉株HBoV1感染性克隆-pIHBoV1wh的构建及其功能鉴定30-32
  • 3.2 插入EGFP基因的感染性克隆pIHBoVwh-GFP的构建及其功能鉴定32-38
  • 第4章 讨论38-42
  • 第5章 结论42-44
  • 5.1 成功构建武汉株博卡病毒感染性克隆pIHBoV1wh42
  • 5.2 成功构建插入EGFP的武汉株博卡病毒感染性克隆pIHBoV1wh-GFP42-44
  • 第二部分 人博卡病毒(HBoV1) NS1、NS1-70 蛋白对NF-κB信号通路的调节44-92
  • 第1章 绪论44-66
  • 1.1 选题的目的和意义44-45
  • 1.2 研究背景45-66
  • 1.2.1 天然免疫系统和NF-κB45-62
  • 1.2.1.1 天然免疫系统(innate immune system)简介45-46
  • 1.2.1.2 天然免疫系统中的模式识别受体46-48
  • 1.2.1.3 NF-κB信号通路简介及其在免疫反应中的作用48-51
  • 1.2.1.4 TNF-α 及其激活的NF-κB信号通路51-54
  • 1.2.1.5 NF-κB家族及p65的翻译后修饰54-57
  • 1.2.1.6 病毒对NF-κB的调节57-62
  • 1.2.2 HBoV的传播途径及流行病学62-63
  • 1.2.3 HBoV感染的诊断和临床症状63-64
  • 1.2.4 HBoV感染的免疫学特征64-66
  • 第2章 材料与方法66-72
  • 2.1 细胞培养、转染66
  • 2.2 质粒构建66-67
  • 2.3 抗体和细胞因子67
  • 2.4 荧光素酶报告实验67
  • 2.5 Western Blot实验67-68
  • 2.6 免疫共沉淀(Co-IP)实验68
  • 2.7 核质分离实验68-69
  • 2.8 免疫荧光(IF)实验69
  • 2.9 RNA提取和real-time PCR实验69
  • 2.10 DNA结合实验69-70
  • 2.11 数据统计学分析70-72
  • 第3章 实验结果72-86
  • 3.1 HBoV1近全长克隆抑制TNF-α 介导的NF-κB激活72
  • 3.2 HBoV1 NS1和NS1-70 蛋白抑制TNF-α 介导的NF-κB激活72-74
  • 3.3 HBoV1 NS1和NS1-70 蛋白干扰NF-κB信号通路74-75
  • 3.4 HBoV1 NS1和NS1-70 不抑制IκBα 的磷酸化和降解75-76
  • 3.5 HBoV1 NS1和NS1-70 蛋白不抑制p65的核转移76-79
  • 3.6 HBoV1 NS1和NS1-70 蛋白与内源性p65相互作用79-81
  • 3.7 HBoV1 NS1和NS1-70 阻止p65结合到 κB DNA元件上81-82
  • 3.8 HBoV1 NS1和NS1-70 与p65 NTD结构域相互作用82-84
  • 3.9 HBoV1 NS1蛋白而不是NS1-70 蛋白能够抑制p65磷酸化84-86
  • 第4章 讨论86-90
  • 第5章 结论90-92
  • 5.1 HBoV近全长克隆抑制TNF-α 介导的NF-κB激活90
  • 5.2 HBoV NS1和NS1-70 蛋白抑制NF-κB信号通路信号传导搭桥蛋白激活的NF-κB90
  • 5.3 HBoV NS1和NS1-70 不影响IκBα 的磷酸化和降解,不抑制p65的核转移90
  • 5.4 HBoV NS1和NS1-70 与p65有相互作用,截短表达发现NS1和NS1-70 与p65 NTD结构域有相互作用90-91
  • 5.5 HBoV NS1和NS1-70 抑制p65结合到 κB DNA元件上91
  • 5.6 HBoV NS1抑制p65磷酸化而NS1-70 不抑制p65磷酸化91-92
  • 参考文献92-102
  • 附录一 缩略词表102-106
  • 附录二 作者简介106-107

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