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《中国科学院武汉病毒研究所》 2017年
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人细小病毒B19类染色质结构调控基因组复制及RNA加工

徐焕洲  
【摘要】:人类细小病毒B19(B19V)属于细小病毒科的嗜红细胞属,基因组为单链DNA,全长5.6kb。B19V和人博卡病毒是现今可以感染人类的仅有的两种细小病毒科的病毒。B19V感染主要引起传染性红斑、急性再生障碍性贫血、关节炎等,感染孕妇后可导致胎儿水肿,流产或者死胎。B19V基因组内有两个polyA信号,位于3'端的称为(pA)d,位于第二个内含子内的称为(pA)p。(pA)p直接抑制病毒转录出全长pre-mRNA,在转录后水平与第二个内含子的剪切相互竞争抑制病毒结构蛋白mRNA的生成,而病毒的复制利于启动子通读过(pA)p位点,使用(pA)d位点。病毒基因组的复制和第二个内含子的剪切都影响(pA)p的使用,但是复制如何影响(pA)p的使用还不清楚。细小病毒MVM和腺相关病毒AAV感染敏感细胞后,可以和组蛋白结合,形成类染色质结构,但是类染色质结构有哪些功能还没有相关报道。因此,本研究主要目的是探讨B19V基因组是否可以在细胞内形成类染色质结构,研究B19V基因组甲基化修饰以及类染色质结构对基因复制和RNA加工的影响,进一步揭示基因组复制影响(pA)p使用的分子机制。为了研究B19V基因组DNA是否形成类染色质结构,转染B19V DNA到HEK293T细胞内,分别在12、24、36和48小时提取细胞核,微球菌核酸酶消化后用苯酚-氯仿抽提,同时在这四个时间段提取Hirt DNA,Southern blot检测。结果证实B19V基因组DNA可以在细胞内形成类染色质结构,且类染色质结构的形成早于复制。为了研究病毒染色质的修饰是否影响病毒的复制、转录或转录后加工,我们应用甲基转移酶抑制剂5-Aza-2’-deoxycytidine(DAC)处理转染B19V基因组DNA后的HEK293T细胞,48小时后提取小分子量DNA(Hirt DNA),利用DpnI消化,用甲基化检测试剂盒处理后进行PCR扩增反应,通过测序我们发现,DAC处理后基因组上特定位点的甲基化修饰被抑制,表明在B19V基因组内存在甲基化修饰位点。用终浓度为20μM的DAC处理转染后的293T细胞,48h后分别提取细胞核、Hirt DNA和总RNA,并用Southern blot和RNA酶保护实验进行检测。结果发现,与DMSO处理组和未处理组比较,DAC明显抑制B19V类染色质结构的形成及基因组的复制。RPA实验证实DAC抑制第二个内含子的剪切,促进(pA)p的使用。为了研究B19V基因组复制影响(pA)p使用的具体机制,分别利用IRES2-eGFP和pBluescript KS II载体构建了基因组5’和3’端一半基因的复制型和非复制型克隆,并在此基础上获得了敲除D1和D2剪切位点的克隆,转染HEK293T细胞,48小时后提取总RNA,RNA酶保护实验进行检测。结果发现B19V基因组的复制主要通过影响第二个内含子的剪切影响(pA)p的使用。本研究证实B19V基因组上存在甲基化修饰,DAC可以使基因组去甲基化,抑制类染色质结构的形成和复制,导致基因组第二个内含子的剪切被抑制,进而影响(pA)p的使用。本研究首次报道了B19V基因组甲基化修饰和类染色质结构影响基因组的复制和RNA转录后加工,揭示了B19V基因组中央poly位点选择性使用的分子调控机制,为B19V的防治提供了理论依据。
【关键词】:细小病毒B19 类染色质结构 DAC 复制 RNA剪切
【学位授予单位】:中国科学院武汉病毒研究所
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;R373
【目录】:
  • 致谢4-6
  • 摘要6-8
  • ABSTRACT8-13
  • 第1章 引言13-27
  • 1.1 人细小病毒B19概述13
  • 1.2 B19V病原学特性13-21
  • 1.2.1 B19V结构和基因组特点13-15
  • 1.2.2 B19V基因编码蛋白的功能15-16
  • 1.2.2.1 非结构蛋白NS115
  • 1.2.2.2 衣壳蛋白(VP1/VP2)15-16
  • 1.2.2.3 11kDa蛋白和 7.5kDa蛋白16
  • 1.2.3 B19V生物学特性16-17
  • 1.2.4 B19V的流行病学17
  • 1.2.5 B19V的致病机制17-18
  • 1.2.6 B19V感染的临床表现18-20
  • 1.2.6.1 红细胞再生障碍性贫血18
  • 1.2.6.2 传染性红斑18
  • 1.2.6.3 关节病18-19
  • 1.2.6.4 肢端瘀斑综合征19
  • 1.2.6.5 血管性紫癜19
  • 1.2.6.6 孕妇感染B19V19-20
  • 1.2.6.7 其他疾病20
  • 1.2.7 B19V感染的诊断20
  • 1.2.8 治疗20-21
  • 1.3 染色质(体)21-25
  • 1.3.1 染色体与染色质21-23
  • 1.3.1.1 真核生物染色质结构21-22
  • 1.3.1.2 病毒染色质结构22-23
  • 1.3.2 染色质结构的功能23-25
  • 1.3.2.1 染色质结构与病毒感染23
  • 1.3.2.2 染色质结构与基因表达23-24
  • 1.3.2.3 染色质与mRNA可变剪切24-25
  • 1.3.3 细小病毒类染色质结构25
  • 1.4 研究目的和意义25
  • 1.5 本研究的主要内容25-27
  • 第2章 材料与方法27-51
  • 2.1 材料27
  • 2.1.1 菌株、细胞系27
  • 2.1.2 质粒、载体27
  • 2.2 主要试剂27-29
  • 2.3 主要工作液的配制29-37
  • 2.4 主要仪器37-38
  • 2.5 主要实验方法38-51
  • 2.5.1 细胞培养38
  • 2.5.2 RNA酶保护实验相关质粒的制备38-51
  • 第3章 实验结果51-77
  • 3.1 质粒的构建51-61
  • 3.1.1 核酸酶保护实验探针制备51-52
  • 3.1.2 B19V复制型质粒的构建52-61
  • 3.2 B19V基因组可以在HEK293T细胞内复制和转录61-62
  • 3.2.1 B19V基因组的制备61
  • 3.2.2 B19V感染性克隆可以在HEK293T细胞内复制和转录61-62
  • 3.3 B19V基因组可以在HEK293T细胞内形成类染色质结构62-63
  • 3.4 B19V基因组DNA类染色质结构形成早于复制63-65
  • 3.5 B19V基因组DNA存在甲基化位点65-66
  • 3.6 B19基因组DNA染色质状态调控基因的表达66-70
  • 3.6.1 MTT检测 5-Aza-2’-deoxycytidine(DAC)对细胞的毒性66-68
  • 3.6.2 DAC影响B19V类染色质结构的形成68-69
  • 3.6.3 DAC影响B19V基因组的复制69-70
  • 3.7 B19基因组DNA的复制间接影响(pA)p的使用70-74
  • 3.7.1 B19V复制通过影响内含子的剪切而影响(pA)p的使用70-72
  • 3.7.2 B19V复制间接影响(pA)p的使用72-74
  • 3.8 DAC影响B19V RNA的转录后加工74-75
  • 3.9 DAC影响B19V (pA)p的使用75-77
  • 第4章 讨论与展望77-82
  • 参考文献82-97
  • 附录97-99
  • 附表1 本文所用的引物信息97-99
  • 作者简历99

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