收藏本站
《中国科学院武汉病毒研究所》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

病毒RdRP的转位和底物选择的结构基础

舒波  
【摘要】:RNA病毒严重威胁着人类健康,大部分由病毒引起的传染性疾病的病原体是RNA病毒。小RNA病毒科病毒的基因组复制过程主要由病毒自身携带的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd RP)催化完成。以病毒的基因组为模板,聚合酶以宿主细胞内的NTP作为底物,将单磷酸核苷(NMP)逐个添加到产物链上,最终生成一条与模板互补配对的RNA链。在复制过程中最为核心的NTP添加过程又被称为核苷酸添加循环(nucleotide addition cycle,NAC),该循环由底物结合并诱导活性中心关闭、磷酰基转移反应以及聚合酶向模板下游转位三个主要步骤构成。这些过程的分子机制是聚合酶领域的核心研究内容。脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)Rd RP-RNA-NTP复合物系列晶体结构为我们揭示了RdRP活性中心关闭的模式,同时该研究也提出了Rd RP转位中间体假设。本文采用与PV相同的复合物构建策略,以肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的Rd RP为研究对象,筛选获得了EV71的Rd RP复合物晶体。通过使用不同方式的晶体浸泡策略,在晶体中实现单个和多个核苷酸添加循环,获得了七个分辨率在2.4-2.9埃之间RdRP复合物晶体结构。这些结构展示了EV71聚合酶催化循环中的多个过程,包括NTP结合、聚合酶的活性中心关闭以及磷酰基转移反应。这些结构也验证了Rd RP与其他类型的聚合酶相比,在活性中心关闭和转位这两个关键步骤上具有鲜明的独特性。同时本研究中展示的转位中间体结构显示,复合物中的模板和产物链在转位的初始过程中采取不对称的运动模式,产物链的转位显著领先于模板链,上游碱基对运动幅度大于下游的碱基对。这种不均一的运动模式为剖析转位机制提供了关键信息。该结构中展示的核酸双链不对称运动从未被观测到,甚至从未被考虑到,因此这项研究将有可能具备对核酸聚合酶领域产生高度影响。
【关键词】:肠道病毒71型 蛋白质晶体学 核苷酸添加循环 转位中间体
【学位授予单位】:中国科学院武汉病毒研究所
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373
【目录】:
  • 致谢4-5
  • 摘要5-6
  • Abstract6-7
  • 主要缩略词表7-12
  • 第一章 研究背景12-38
  • 1.1 小RNA病毒12-15
  • 1.1.1 小RNA病毒科病毒的基因组结构12-13
  • 1.1.2 小RNA病毒的生活周期13-15
  • 1.2 EV71病毒研究现状15-23
  • 1.2.1 EV71概述15
  • 1.2.2 EV71蛋白质组学研究进展15-23
  • 1.3 RdRP(3D)简介23-27
  • 1.3.1 聚合酶的生物活性23-25
  • 1.3.2 依赖RNA的RNA聚合酶的结构25-26
  • 1.3.3 依赖RNA的RNA聚合酶的N端结构26-27
  • 1.4 小RNA病毒聚合酶的与RNA的延伸复合物27-32
  • 1.4.1 PV复合物的结构特征28-29
  • 1.4.2 RdRP延伸催化循环29-30
  • 1.4.3 聚合酶活性中心关闭构象30-32
  • 1.5 小RNA病毒聚合酶的保真度研究32-34
  • 1.5.1 聚合酶活性中心口袋32-33
  • 1.5.2 N端结合口袋33
  • 1.5.3 基序A与聚合酶保真度33-34
  • 1.5.4 基序D与聚合酶的保真度34
  • 1.6 转位的相关研究34-36
  • 1.7 本课题的研究意义36-38
  • 第二章 实验材料与实验方法38-60
  • 本章简介38-39
  • 2.1 EV71-SK-3D~(pol)原核表达载体的构建39-41
  • 2.1.1 引物设计39
  • 2.1.2 PCR(聚合酶链反应)扩增目的片段39-40
  • 2.1.3 含有黏性模板的模板提取40
  • 2.1.4 酶切载体40
  • 2.1.5 酶连体系40-41
  • 2.1.6 质粒的转化和挑选克隆41
  • 2.1.7 酶切鉴定41
  • 2.2 SK-C291M突变体载体构建构建41-43
  • 2.2.1 QuickChange原理以及引物设计41-42
  • 2.2.2 PCR扩增出突变序列42
  • 2.2.3 酶切原始载体42
  • 2.2.4 质粒的转化和挑选克隆42
  • 2.2.5 测序鉴定42-43
  • 2.3 EV71-SK-3D蛋白表达43-46
  • 2.3.1 分析蛋白序列43
  • 2.3.2 表达载体的转化43
  • 2.3.3 病毒聚合酶大规模诱导43-44
  • 2.3.4 SDS-PAGE检测蛋白表达量44
  • 2.3.5 菌种破碎44
  • 2.3.6 EV71-SK-3D的纯化44-45
  • 2.3.7 蛋白浓度测定45-46
  • 2.3.8 蛋白的纯化效果鉴定46
  • 2.4 RNA制备46-51
  • 2.4.1 RNA制备原理46-47
  • 2.4.2 RNA_V5-5 引物模板设计47
  • 2.4.3 PCR反应47-48
  • 2.4.4 体外转录48-49
  • 2.4.5 体外自剪切49
  • 2.4.6 小胶检测RNA转录与剪切效果49
  • 2.4.7 尿素聚丙烯酰胺胶纯化RNA49-50
  • 2.4.8 EluTrap纯化RNA50
  • 2.4.9 乙醇沉淀50
  • 2.4.10 RNA含量测定以及保存50-51
  • 2.5 复合物的组装与纯化51-53
  • 2.5.1 RNA_V5-5+P10组装51
  • 2.5.2 聚合酶复合物活性测试51
  • 2.5.3 聚合酶RNA复合物大规模组装51-52
  • 2.5.4 聚合酶RNA复合物纯化52
  • 2.5.5 超滤浓缩以及置换溶液52
  • 2.5.6 复合物浓度测定52
  • 2.5.7 复合物稳定性测试52-53
  • 2.6 复合物筛选晶体53-54
  • 2.6.1 蛋白质晶体生长原理53
  • 2.6.2 蛋白质结晶条件的筛选53
  • 2.6.3 复合物晶体的重复及优化53-54
  • 2.7 浸泡实验54-55
  • 2.7.1 配置浸泡溶液54
  • 2.7.2 浸泡操作54
  • 2.7.3 浸泡策略54-55
  • 2.8 数据处理55-57
  • 2.8.1 X射线晶体学的发展55
  • 2.8.2 晶体的空间群55
  • 2.8.3 数据收集55-56
  • 2.8.4 结构解析56-57
  • 2.9 部分溶液的配方57-60
  • 2.9.1 病毒蛋白纯化溶液57-58
  • 2.9.2 聚合酶与RNA复合物纯化溶液58-59
  • 2.9.3 其他溶液59-60
  • 第三章 实验结果与讨论60-92
  • 3.1 EV71聚合酶复合物的结晶与结构解析60-76
  • 3.1.1 分子克隆结果60-62
  • 3.1.2 突变体结果62
  • 3.1.3 表达纯化结果分析62-63
  • 3.1.4 AKTA纯化EV71-S K-3D蛋白63-66
  • 3.1.5 RNA_V5-5 的制备66-68
  • 3.1.6 SK-RNA_V5-5 复合物的制备68-71
  • 3.1.7 EV71-SK-RNA_V5-5 晶体筛选与优化71-75
  • 3.1.8 EV71-SK-C291M-RNA_V5-5 晶体的筛选与浸泡75-76
  • 3.2 RNA 病毒聚合酶核苷酸添加循环机制研究76-92
  • 3.2.1 EV71-SK-3D-RNA_V5-5 复合物结构特征76-78
  • 3.2.2 NTP结合的起始阶段78-79
  • 3.2.3 NTP结合的过程79-81
  • 3.2.4 聚合酶活性中心的关闭和催化反应81-83
  • 3.2.5 模板正一位为A时的活性中心口袋83-84
  • 3.2.6 模板正一位为A时的关闭构象84-87
  • 3.2.7 转位中间体87-89
  • 3.2.8 C291M-RNA_V5-5 浸泡结果分析89-92
  • 第四章 总结与展望92-96
  • 参考文献96-106
  • 作者简历106-107

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 秦咸蕴;林霖;杨燕;张书香;孔建强;程克棣;赵云峰;王伟;;EV71非结构蛋白的结构和功能及其为靶点的药物研究进展[J];药学学报;2011年07期
2 张显升,任艳,魏艳丽,李红梅,王少杰,蒋宏彬,谢庆阁;小RNA病毒蛋白翻译调控元件研究进展[J];中国生物工程杂志;2004年06期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐骁;姚云芳;李靖;柴克莉;乔文涛;谈娟;;肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定[J];病毒学报;2016年05期
2 原素梅;徐超;张煦;王源;谢冰玉;熊庆;彭宜红;;EV71-2A突变质粒的构建及体内外功能初探[J];微生物学免疫学进展;2016年03期
3 杨健;张芳;杨靖翔;余睿;郭咸希;;新型抗EV71病毒3C蛋白酶抑制药的设计、合成及其活性[J];中国药师;2015年10期
4 原素梅;彭宜红;;人肠道病毒2A蛋白酶生物学作用研究进展[J];微生物学免疫学进展;2015年06期
5 刘艳;李冰清;孟红;;小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物[J];生物技术通报;2014年08期
6 韩成昊;李平花;白兴文;包慧芳;卢曾军;孙普;曹轶梅;刘在新;;型内非编码区嵌合口蹄疫病毒的拯救及生物学特性分析[J];中国兽医科学;2013年11期
7 罗雷;朱汝南;;人副肠孤病毒的研究进展[J];中国病毒病杂志;2013年04期
8 张迎秋;杨怀义;杨倬;时迎娣;赵春晖;;EV71感染抗病毒药物及疫苗研究进展[J];微生物学通报;2012年04期
9 崔丽瑾;王兴龙;任晓慧;任林柱;郎需龙;杨艳玲;李晓艳;卜朝阳;;靶向IRES序列的siRNA对口蹄疫病毒体外增殖抑制效果[J];中国兽医学报;2010年05期
10 崔丽瑾;王兴龙;任林柱;李晓艳;郎需龙;张付贤;王英超;;靶向口蹄疫病毒IRES区RNA干扰位点的选择及shRNA表达载体的构建与鉴定[J];动物医学进展;2010年03期
【相似文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 舒波;病毒RdRP的转位和底物选择的结构基础[D];中国科学院武汉病毒研究所;2017年
中国知网广告投放
相关机构
>中国科学院武汉病毒研究所
相关作者
>舒波
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026