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《第三军医大学》 2001年
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超抗原SEA诱导T细胞失能的分子机制研究

许桂莲  
【摘要】: 在免疫学界,免疫耐受一直是研究的重点和难点。失能是机体维持外 周免疫耐受的一个主要机制。近年来T细胞失能机制的研究已成为免疫学 研究的一个热点。 超抗原是一类新型的抗原分子,它以TCRV_β特异性的方式直接激活大 量T细胞。其激活T细胞的独特方式,决定了超抗原具有重要的生物学效 应。其中,引起T细胞克隆失能和删除便是其重要生物学影响之一。 为探讨T细胞失能的分子机制,几个研究组进行了一些研究。研究结 果表明:失能T细胞中,IL-2基因转录受到伤害是由于TCR活化诱导的 p21~(Ras)及其下游MAPK途径受阻所致,即所谓的“Ras-blocked”失能。另 外还涉及到转录因子AP-1、NF-κB、NF-AT、c-Fos、FosB、JunB,负性 调节因子和RaP1。最近,有研究者在体内诱导的T细胞失能中,发现失能 是通过选择性地损害TCR活化诱导的Ca/calcineurin途径来诱导和维持的。 少量钙离子载体的加入就能恢复此失能状态,说明这是一种有别于上述失 能的“Calcium-blocked”失能。然而,这仅仅是T细胞活化信号的中下游 事件。造成这些TCR信号下游受阻事件的上游事件是什么?作为对T细 胞活化起关键作用的共刺激分子,CD28/CTLA-4在超抗原诱导的T细胞失 能中分别扮演何种角色呢?人们对T细胞失能的胞内生化基础很不清楚。 这些问题的阐明对探讨免疫耐受本质的起着关键作用。 超抗原与T细胞相互作用的MHCⅡ类分子非限制性以及大量活化T 细胞的特性,使体外失能模型的建立成为可能。本课题通过在体外,用超 抗原SEA诱导人外周血T细胞的失能,从而首次建立了超抗原诱导T细 胞失能的体外模型,并首次对超抗原诱导的人外周血T细胞失能分子机制 进行了研究。实验内容及结果主要包括以下几个方面: 1.超抗原SEA对外周血了细胞的活化特点 初始T细胞接触超抗原后会产生强烈的增殖反应,对抗原的再次刺激, T细胞表现出无反应性。也就是说免疫耐受是T细胞被超抗原活化的后续 过程。对超抗原活化T细胞的特点进行了解是研究免疫耐受的前提。 SEA是一种葡萄球菌分泌的外毒素,也是研究最清楚的一种超抗原。 我们用超抗原SEA刺激从外周血分离出的PBMC,全面系统地研究了SEA 对人外周血 T细胞的活化特点:①采用 3H1dR掺入法实验发现 SEA活化 T细胞的最佳浓度范围为 10上0‘"g/mL。②双抗体夹心 ELISA $表明 SEA 对T细胞的活化作用在第二、3天达高峰。③通过FACS分析SEA初次刺 激和再次刺激的T细胞CD4和CDS表型,发现T细胞不管是初次或再次 接触SEA,SEA对CD4“和CDS“T细胞两亚群起同等程度的活化作用,而 不改变CD4/CDS表型。 2.建立超抗原SEA诱导了细胞失能的体外模型 研究T细胞失能机制的前提是建立一合适的失能模型。为此,我们做 了以下工作:①短期静息SEA反应性T细胞系的建立。首先加入超抗原 SEA活化PBMC,72h后,去除SEA,力入rhIL-二(100U/!nL),以扩增SEA 反应性T细胞,去除未反应性的细胞。经过两周以上的维持,可得到高纯 度的静息SEA反应性T细胞。②证明经过处理后的PBMC可作为超抗原 SEA 的抗原提呈细胞。将新鲜分离出的PBMC 经Y.射线照射或用 MitoffiyCillC处理后,其增殖能力受到抑制,但保留了其提呈抗原作用。 用这种方法处理过的细胞可成功地提呈SEA到T细胞,使T细胞活化。 ③通过HyPaqueIicoll密度梯度离心法可成功地将经SEA多次刺激过的 SEA反应性T细胞与非反应性细胞分离开来,FACS分析所得到的细胞95% 以上为SEA反应性T细胞。④证明了在体外经SEA多次刺激过的T细胞 处于一无反应状态:将静息短期SEA反应性T细胞与经SEA多次刺激过 的T细胞接种培养板,用经上述方法处理过的PBMC作抗原提呈细胞,加 x 入SEA,置于CO。孵箱中培养72h。’H1dR掺入法检测各孔细胞的增殖。 ELISA检测各孔细胞培养48h上清的IL-2浓度。结果表明经SEA多次刺 激过的T细胞处于失能状态,受SEA的再次刺激时,不能增殖,IL上产 生缺乏。从而首次建立了超抗原诱导T细胞失能的体外模型。 3.超抗原SEA诱导丁叁胞失能白分子机未 ①超抗原 SEA诱导的失能 T细胞,IL-ZR a链表达正常,外源性 IL,2 的加入可逆转其失能状态。PMA单独作用能部分恢复T细胞的增殖,但 **A与1加**yeh的复合作用则更大程度地使T细胞的失能状态得到恢 复。从而首次发现失能T细胞之所以不能增殖,是由于T细胞活化诱导的 信号转导到胞核的Ras/MAPK途径和 Ca/calcineurin途径受阻,从而使IL上 基因不能正常转录。②失能T细胞中,对IL上基因转录起重要作用的转录 因子AP八转录活性减弱,且组份缺陷,这与失能T细胞中IL-2产生缺乏 或减少有关;NF上appaB的转录活性却强于活化组T细胞。其在夫能诱导 和维持中的作用有待进一步探讨。③超抗原SEA诱导的
【关键词】:超抗原;SEA;失能;T淋巴细胞;外周免疫耐受;CD28; CTLA-4;负性信号;转录因子;AP-1;NF-kappaB
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R392.11
【目录】:
  • 英文缩写词表3-7
  • 英文摘要7-11
  • 中文摘要11-14
  • 论文正文 超抗原SEA诱导T细胞失能的分子机制研究14-83
  • 前言14-18
  • 第一章 超抗原SEA对外周血T淋巴细胞的活化作用18-29
  • 第一节 外周血单个核细胞(PBMC)的分离18-20
  • 第二节 超抗原SEA对T细胞的活化作用20-27
  • 第三节 讨论27-29
  • 第二章 超抗原SEA诱导T细胞失能的体外模型29-48
  • 第一节 短期静息SEA反应性T细胞系的建立30-36
  • 第二节 超抗原SEA的反复刺激诱导T细胞的失能36-44
  • 第三节 讨论44-48
  • 第三章 IL-2/IL-2R在超抗原SEA诱导T细胞失能中的作用48-59
  • 第四章 转录因子AP-1、NF-kappaB在失能T细胞中的表达59-71
  • 第五章 CD28/CTLA-4在超抗原SEA诱导T细胞失能中的作用71-81
  • 第六章 结论81-83
  • 致谢83-84
  • 参考文献84-99
  • 文献综述一99-121
  • 文献综述二121-128
  • 文献综述三128-135
  • 攻读学位期间发表的文章135

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